Penjujukan Gen: Wawasan Teknologi dan Kesan Mendalam terhadap Kemanusiaan

Polimerase DNA memainkan peranan penting dalam diagnostik molekul, yang ditunjukkan terutamanya dalam aspek berikut:

• Reaksi Rantai Polimerase (PCR)
  • Penguatan DNA: PCR ialah teknik yang biasa digunakan dalam diagnostik molekul untuk menguatkan kuantiti serpihan DNA tertentu untuk menjadikannya boleh dikesan dan boleh dianalisis. DNA polimerase ialah enzim teras dalam tindak balas PCR. Ia menggunakan DNA untai tunggal sebagai templat dan, mengikut prinsip pasangan pelengkap asas, menambah deoksinukleotida bebas satu demi satu ke hujung 3'-OH primer untuk mensintesis untaian DNA baharu yang pelengkap kepada untai templat, mencapai penguatan eksponen serpihan DNA. Melalui PCR, jumlah surih sampel DNA boleh diperkuatkan ke tahap yang boleh dikesan, meningkatkan sensitiviti pengesanan.
  • Memastikan Ketepatan Penguatan: Polimerase DNA kesetiaan tinggi mempunyai aktiviti exonuclease 3'→5′, yang boleh membetulkan nukleotida yang tidak diperbadankan semasa sintesis DNA. Ia boleh mengeksai tepat pada masanya pangkalan yang tidak dipasangkan dengan betul dan menambah asas yang betul, dengan itu mengurangkan kadar ralat semasa penguatan PCR dan memastikan ketepatan produk yang dikuatkan, menyediakan sampel DNA yang boleh dipercayai untuk analisis diagnostik seterusnya.
• PCR Pendarfluor Kuantitatif (qPCR)
  • Analisis kuantitatif: Dalam qPCR, polimerase DNA juga bertanggungjawab untuk penguatan DNA. Dengan menambahkan kumpulan pendarfluor pada sistem tindak balas PCR, proses penguatan PCR boleh dipantau dalam masa nyata menggunakan perubahan dalam isyarat pendarfluor. Walaupun polimerase DNA menguatkan DNA, isyarat pendarfluor meningkat apabila bilangan salinan DNA meningkat. Mengikut nombor kitaran (nilai Ct) apabila isyarat pendarfluor mencapai ambang yang ditetapkan, DNA templat permulaan boleh dianalisis secara kuantitatif. Ini sangat penting untuk pemantauan beban patogen, analisis kuantitatif ekspresi gen, dsb., dan berguna untuk diagnosis penyakit, pemantauan rawatan dan penilaian prognosis.
• Penjujukan Gen
  • Sintesis DNA untuk Tindak Balas Penjujukan: Dalam kaedah penjujukan Sanger, polimerase DNA digunakan untuk mensintesis untaian baru yang pelengkap kepada DNA templat. Sebagai tambahan kepada deoxynucleotides biasa, sejumlah kecil dideoxynucleotides berlabel pendarfluor (ddNTPs) ditambah kepada sistem tindak balas. Apabila ddNTP digabungkan secara rawak ke dalam helai DNA yang disintesis, ia menamatkan lanjutan untaian DNA, menghasilkan satu siri serpihan DNA dengan panjang yang berbeza. Serpihan ini dipisahkan oleh elektroforesis dan dikesan oleh pendarfluor, membolehkan penentuan urutan DNA. Dalam teknologi penjujukan generasi akan datang, seperti teknologi penjujukan generasi kedua berdasarkan prinsip penjujukan secara sintesis, polimerase DNA juga merupakan enzim utama untuk sintesis dan penjujukan DNA, memastikan penambahan nukleotida yang tepat dalam setiap kitaran dan menentukan jujukan DNA dengan mengesan penggabungan nukleotida.
• Genotip
  • Penguatan Khusus Alel: Dalam beberapa kaedah genotaip, ciri-ciri polimerase DNA digunakan untuk penguatan khusus alel. Dengan mereka bentuk primer khusus yang menjadi pelengkap kepada asas khusus alel sasaran pada hujung 3′, polimerase DNA boleh memanjangkan primer dengan berkesan hanya apabila primer sepadan sepenuhnya dengan templat. Dengan cara ini, alel yang berbeza boleh dibezakan, yang digunakan untuk genotaip gen berkaitan penyakit, penyelidikan farmakogenomik, dan lain-lain, membantu doktor membangunkan pelan rawatan yang diperibadikan mengikut ciri genetik pesakit.
• Hibridisasi Molekul Asid Nukleik
  • Pelabelan Probe: Dalam teknologi hibridisasi molekul asid nukleik, probe DNA perlu dilabelkan untuk pengesanan. Polimerase DNA boleh digunakan untuk melabel probe dengan kaedah seperti terjemahan nick atau kaedah primer rawak. Sebagai contoh, dalam kaedah penterjemahan samaran, DNase I mula-mula digunakan untuk menghasilkan beberapa samaran beruntai tunggal dalam probe DNA. Kemudian, DNA polimerase I menggunakan aktiviti exonuclease 5'→3′ untuk mengeluarkan segmen DNA pada nick dan, pada masa yang sama, menggunakan aktiviti polimerase 5'→3′ untuk menambah deoxynucleotides berlabel pada hujung 3′ nick, dengan itu menyediakan probe DNA berlabel untuk mengesan jujukan asid nukleik tertentu.