Apakah langkah-langkah yang diperlukan untuk pengekstrakan PCR?

PCR (Polymerase Chain Reaction) ialah teknik yang digunakan untuk menguatkan jujukan DNA. Proses itu sendiri dipanggil amplifikasi PCR dan bukannya pengekstrakan, tetapi ia sering melibatkan pengekstrakan DNA awal daripada sel atau tisu. Berikut ialah langkah umum untuk PCR:

1. Pengekstrakan DNA

Sebelum PCR, anda perlu mengekstrak DNA daripada sel. Ini melibatkan beberapa langkah:

a. Koleksi Contoh

• Kumpulkan sel atau tisu daripada sumber (cth, darah, air liur, biopsi tisu).

b. Lisis Sel

• Pecahkan sel untuk melepaskan DNA menggunakan kaedah fizikal (seperti pengisaran atau sonication) atau kaedah kimia (menggunakan detergen dan enzim).

c. Pemurnian DNA

• Buang protein dan bahan cemar lain menggunakan pengekstrakan fenol-kloroform, pemendakan etanol atau kit pengekstrakan DNA komersial.

2. Penguatan PCR

Sebaik sahaja anda mempunyai DNA yang telah disucikan, anda boleh meneruskan dengan penguatan PCR:

a. Penyediaan Campuran Tindakbalas PCR

• DNA templat: DNA yang diekstrak yang mengandungi jujukan sasaran untuk dikuatkan.
• Primer: Jujukan DNA untai tunggal pendek yang merupakan pelengkap kepada jujukan mengapit kawasan DNA sasaran.
• dNTPs (Deoxynucleotide Triphosphates): Blok binaan untuk sintesis untai DNA baharu.
• Taq DNA Polimerase: Enzim tahan haba yang mensintesis helai DNA baharu.
• Penyelesaian Penyangga: Mengekalkan pH optimum dan kekuatan ion untuk tindak balas.
• MgCl₂: Kofaktor yang diperlukan untuk aktiviti Taq polimerase.

b. Langkah-langkah Kitar Termo

Campuran tindak balas PCR diletakkan di dalam thermocycler, yang mengubah suhu dalam kitaran. Langkah-langkah utama dalam setiap kitaran ialah:

• Denaturasi (94-98°C): DNA untai dua cair terbuka kepada untai tunggal.
• Penyepuhlindapan (50-65°C): Primer mengikat (sepuhlindap) kepada urutan pelengkapnya pada DNA untai tunggal.
• Sambungan (72°C): Taq polymerase menambah dNTP pada primer, memanjangkan untaian DNA dan mensintesis untaian pelengkap yang baharu.

c. Berbasikal

• Thermocycler mengulangi langkah ini untuk 20-40 kitaran, yang membawa kepada penguatan eksponen urutan DNA sasaran.

3. Analisis Selepas PCR

Selepas amplifikasi PCR, produk boleh dianalisis menggunakan pelbagai kaedah:

• Elektroforesis Gel: Untuk menggambarkan serpihan DNA yang dikuatkan.
• Urutan: Untuk menentukan urutan tepat DNA yang dikuatkan.
• Pengiraan: Menggunakan kaedah seperti qPCR (PCR kuantitatif) untuk mengukur jumlah DNA.

Ini adalah langkah umum untuk PCR, daripada pengekstrakan DNA kepada amplifikasi dan analisis. Butiran khusus boleh berbeza-beza bergantung pada aplikasi dan jenis PCR yang dilakukan.