Apakah Ujian RT-PCR?

Apakah Ujian RT-PCR?

RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) ialah teknik biologi molekul yang menggabungkan transkripsi terbalik dan PCR, terutamanya digunakan untuk mengesan virus RNA atau menganalisis tahap ekspresi RNA. Di bawah ialah pecahan terperinci prinsip, prosedur, aplikasinya dan banyak lagi:

I. Prinsip Teras

Intipati RT-PCR sedang bertukar RNA ke dalam cDNA melalui transkripsi terbalik, kemudian secara eksponen menguatkan cDNA melalui PCR untuk membolehkan pengesanan atau kuantifikasi surih RNA. Logik teras ialah: RNA → cDNA → amplifikasi DNA → pengesanan isyarat.

II. Langkah Utama dan Butiran Teknikal

1. Penyediaan Sampel dan Pengekstrakan RNA

• Jenis Sampel: Darah, tisu, sel, air liur, dsb. (mengandungi RNA sasaran, seperti RNA virus atau mRNA).
• Kaedah Pengekstrakan:
  • Kaedah TRIzol: Menggunakan guanidine isothiocyanate untuk melisiskan sel, menyahaktifkan RNase, dan mengekstrak RNA melalui stratifikasi kloroform, sesuai untuk sampel rutin.
  • Kaedah Manik Magnet: Manik magnet yang diubah suai oligonukleotida (cth, Oligo dT) secara khusus mengikat kepada mRNA, disucikan melalui pengasingan magnet, sangat automatik untuk ujian berskala besar.
• Langkah berjaga-jaga: RNA terdedah kepada degradasi RNase; gunakan bahan habis pakai bebas RNase dan simpan sampel pada suhu rendah (cth, -80°C).

2. Transkripsi Songsang (Sintesis cDNA)

• Transkripase Terbalik: Lazimnya AMV (virus myeloblastosis avian RT) atau M-MLV (virus leukemia moloney murine leukemia RT), memerlukan dNTP, primer (primer rawak, Oligo dT, atau primer khusus) dalam penimbal.
• Keadaan Tindak Balas:
  • Suhu: 37–50°C (dilaraskan mengikut jenis enzim, cth, M-MLV berfungsi pada suhu yang lebih rendah).
  • Masa: 30 minit hingga 1 jam untuk penukaran RNA-ke-cDNA.

3. Penguatan PCR

• Komponen sistem: templat cDNA, polimerase DNA Taq, dNTP, primer khusus (reka bentuk untuk gen sasaran), penimbal (含 Mg²⁺).
• Proses Kitaran (30–40 kitaran):
  • Penolakan: 94–95°C, 15–30 saat, untuk melepaskan helaian DNA.
  • penyepuhlindapan: 55–65°C, 30 saat, untuk pengikatan templat primer.
  • Lanjutan: 72°C, 30–60 saat, untuk enzim Taq mensintesis helai baru.
• Pengesanan Produk:
  • Elektroforesis Gel: Asingkan produk PCR melalui gel agarose, pewarna dengan EB untuk memerhati jalur sasaran (untuk analisis kualitatif).
  • qRT-PCR Pendarfluor masa nyata: Tambah probe pendarfluor (cth, probe TaqMan), yang mengeluarkan isyarat semasa penguatan untuk kuantifikasi masa nyata.

III. Jenis dan Perbezaan Utama

IV. Medan Aplikasi

1. Diagnosis Perubatan

• Pengesanan Virus: Virus RNA seperti SARS-CoV-2, HIV, virus denggi, virus hepatitis.
• Diagnosis Penyakit Genetik: Mengesan keabnormalan mRNA daripada mutasi gen (cth, cystic fibrosis, atrofi otot tulang belakang).

2. Penyelidikan Biologi Molekul

• Analisis Ekspresi Gen: Mengukur tahap mRNA dalam sel/tisu (cth, kesan ubat melalui RT-qPCR).
• Penyelidikan Virus RNA: Menganalisis variasi dan replikasi genom (cth, hanyutan antigen influenza).

3. Forensik dan Epidemiologi

• Menaip Viral: Perkuatkan gen virus yang dipelihara untuk penjujukan bagi mengesan sumber jangkitan (cth, COVID-19 溯源).
• Pengesanan Sampel Jejak: RT-PCR bersarang untuk analisis RNA dalam sampel forensik (noda darah, air liur).

V. Langkah berjaga-jaga dan Had

1. Pertimbangan Utama

• Anti-pencemaran: Sertakan kawalan negatif (tiada templat) dan positif (RNA diketahui) untuk mengelakkan positif palsu daripada pencemaran RNA/cDNA makmal.
• Reka Bentuk Primer: Sasarkan kawasan RNA yang dipelihara untuk mengelakkan pengesanan terlepas disebabkan variasi jujukan (kemas kini primer untuk virus mutan).
• Kualiti Sampel: Kecekapan atau degradasi pengekstrakan RNA yang rendah menyebabkan negatif palsu; menilai ketulenan RNA melalui spektrofotometri (nisbah A260/A280) atau elektroforesis.

2. Batasan

• Tempoh Tetingkap: Tahap RNA virus yang rendah dalam jangkitan awal mungkin menghasilkan negatif palsu (cth, dalam tempoh 2 minggu selepas jangkitan HIV).
• Ralat Kuantifikasi: Keputusan qRT-PCR dipengaruhi oleh kecekapan primer dan kecekapan transkripsi terbalik, yang memerlukan penormalan dengan gen rujukan (cth, GAPDH).
• Kerumitan Operasi: Pengekstrakan RNA dan transkripsi terbalik memerlukan kawalan suhu yang ketat, menuntut piawaian makmal yang lebih tinggi.

VI. Perbandingan dengan Teknik Lain

• berbanding PCR: PCR mengesan DNA secara langsung, manakala RT-PCR menukar RNA kepada cDNA terlebih dahulu, sesuai untuk virus RNA atau analisis ekspresi.
• vs Penjujukan Asid Nukleik: RT-PCR menyasarkan jujukan RNA yang diketahui, manakala jujukan menganalisis jujukan yang tidak diketahui atau keseluruhan genom tetapi lebih mahal dan lebih memakan masa.